今さら聞けない プロテオミクスの基礎
プロテオミクスの基礎事項をまとめました。各種教育セミナーなどのために用意した資料も順次公開していく予定です。
目次
・プロテオミクス関連の出来事
・ペプチドを測る
・ショットガン分析
・エレクトロスプレーイオン化法
・生成イオン（プロダクトイオン）スペクトルの例
・生成イオン（プロダクトイオン）スペクトルの例
・修飾ペプチドの回収： リン酸化ペプチドの場合
・修飾ペプチドの回収： 選択回収の効果
・プロテオミクスで使われている質量分析計
・ボトムアップとトップダウン
・LC-MS/MSデータの二次元表示
・検出強度の再現性
・非標識法と標識法
・同位体原子の導入
・標識法の考え方
・非標識法と標識法の比較
・配列データベース検索の構成要素
・配列データベース検索の考え方
・Target-Decoy検索の原理
・Decoy配列の作り方
・Target-Decoy検索の結果
プロテオミクス関連の出来事
物事の全体を俯瞰するにはまず歴史から、ということで、プロテオミクス関連のおもな出来事を年代順に並べてみました（図）。「Proteomics」の語が初めて現れたのは1994年なのですが、現在使われている基幹技術のいくつかはこの年以前に開発されたので前史も重要です。2000年以降に国際組織の設立や専門誌の創刊が続いています。
プロテオミクス年表
2017年11月14日掲載
ペプチドを測る
プロテオミクスの質量分析では、ほとんどの全ての場合でペプチド断片の混合物を直接の測定試料とします。このことを単純な絵で示しました。
プロテオミクスの質量分析ではペプチドの混合物を測定試料とする
電気泳動でバンドとして展開される単一のタンパク質はもちろんのこと、細胞溶解液のように千種類を優に超えるタンパク質混合物でも基本は同じです。つまり、基質特異性の高いタンパク質分解酵素（おもにトリプシン）を添加して試料タンパク質を短鎖のペプチドにします。こうして得られたペプチド混合物を質量分析計に導入します。プロテオミクス技術のセントラルドグマと言ってよいほど受け入れられている手順であり、この手順を使って現在までに多くの成果が挙がっていることは皆さんもご存知の通りです。
個々のタンパク質分子は、大きさ、電荷、溶媒への溶けやすさなどの性質が実にさまざまです。こういった分子群をそのまま特定の分析システム（この場合はLC-MS/MS）で網羅的に分離検出するのはたいへんですが、タンパク質としてどんな厄介な特性をもっていたとしても、そのアミノ酸配列の中には分析しやすい領域もいくらか含んでいることが期待できます。ペプチドに断片化する理由を少し乱暴に説明するとこんなふうになります。それでも、もともと複雑なタンパク質の組成をさらに面倒なことにしている感は否めません。実際に、ある特定のペプチド同定の情報が複数のタンパク質にまたがって帰属する例や、タンパク質あたりの各修飾体の種類が求めにくくなるなどのため、分析の現場ではデータの解釈に慎重になります。
一方で、タンパク質を分解することなくそのままLC-MS/MSに導入する方法も実用化に向けて研究が進められています。このアプローチは「トップダウンプロテオミクス」と呼ばれていて、質量分析計の性能の向上が大きく貢献しています。上に述べたプロテオミクスの常識も早晩過去のものになってしまうかもしれません。
2018年1月13日掲載
ショットガン分析
続いてペプチドの質量測定です。ペプチド混合物は、微流速の液体クロマトグラフにタンデム質量分析計が接続した分析システム (LC-MS/MS) に導入されます。
ショットガン分析の模式図
上図ではデータ依存的取得法 (Data-dependent acquisition, DDA) の様子を示しました。質量分析計内では2つの測定モードでそれぞれイオン化ペプチド群の質量スペクトルとプロダクトイオンの質量スペクトルを取得します。測定中は両走査が高速で切り替わり、たとえば前者1回の直後に後者の走査が10回連続で続くような編成を取ります。開裂反応に供するイオン化ペプチドを各イオンの検出強度に応じて（データ依存的に）自動選択するためにこの名 (DDA) があります。なお、イオン化ペプチド単位で選択せずに、設定したm/z幅に収まるイオンをm/zをずらしながら一斉に開裂反応に供する走査モードも開発されています。このデータ非依存的取得法 (Data-independent acquisition, DIA) は、DDAよりもプロテオームの同定網羅性が高い測定法として有力です。
2022年5月11日更新
エレクトロスプレーイオン化法
エレクトロスプレーは、LCとMS/MSのインターフェースとしてプロテオミクスに限らず広範に使われているイオン化法です。
エレクトロスプレーイオン化法 (ESI) の原理
2018年10月23日掲載
生成イオン（プロダクトイオン）スペクトルの例
リン酸化ペプチドとその非修飾体のプロダクトイオンスペクトル
2018年10月23日掲載
生成イオン（プロダクトイオン）スペクトルの例
ユビキチンン化ペプチドのプロダクトイオンスペクトル
2018年10月23日掲載
修飾ペプチドの回収： リン酸化ペプチドの場合
2018年10月23日掲載
修飾ペプチドの回収： 選択回収の効果
2018年10月23日掲載
プロテオミクスで使われている質量分析計
質量分析部による分類
2018年7月10日掲載
ボトムアップとトップダウン
2018年10月23日掲載
LC-MS/MSデータの二次元表示
2018年10月23日掲載
検出強度の再現性
2018年10月23日掲載
非標識法と標識法
2018年10月23日掲載
同位体原子の導入
2018年10月23日掲載
標識法の考え方
2018年10月23日掲載
非標識法と標識法の比較
2018年10月23日掲載
配列データベースの構成要素
2018年10月23日掲載
配列データベース検索の考え方
配列データベース検索によるペプチド/タンパク質の同定
2018年7月10日掲載
Target-Decoy検索の原理
2018年10月23日掲載
Decoy配列の作り方
2018年10月23日掲載
Target-Decoy検索の結果
2018年10月23日掲載
